17自從列文虎克**次看到活細胞以來，顯微成像技術(shù)已經(jīng)成為生物學領(lǐng)域的重要工具。

   

   

橙色球就是這次的新冠肺炎

   

從組織、細胞、細胞器到細胞蛋白，人類在科學道路上仍在尋找，對顯微技術(shù)的要求也越來越高。

   

不幸的是，光學顯微鏡通過簡單的研磨鏡片制作已經(jīng)不能滿足需求，科學家們看到了新型冠狀病毒(以下簡稱COVID-19）工具不是光學顯微鏡。

   

本文將首先解釋光學顯微鏡的困境，然后介紹兩種可以看到的方法COVID-19的顯微鏡。

   

光學顯微鏡

   

   

光路是黃色的

   

通過透鏡和小孔，光源出來的光攜帶樣品信息會在這些地方發(fā)生 衍射。

   

比如經(jīng)過小孔時，一束平行光應(yīng)被視為一列密集的點光源（下圖單縫處），點光源發(fā)出的球面波相互疊加后會出現(xiàn)明暗交替的同心圓環(huán)（ 艾里斑，下圖右上）。

   

   

這個過程類似于水波通過狹窄的縫隙反映光的波動性。

   

   

雙縫衍射水波

   

如果我們想在顯微鏡下認出它COVID-19，一束光不夠。至少要看病毒和周圍環(huán)境的界面。

   

假如COVID-19在顯微鏡光路衍射后，會形成兩個艾里斑，如果它們太近，就無法區(qū)分病毒和環(huán)境之間的差異。

   

   

原則上，包括光學顯微鏡在內(nèi)的任何顯微鏡，COVID-19與環(huán)境的距離小到一定程度后就無法區(qū)分了。這個距離可以用阿貝公式數(shù)字化解釋:

   

   

如果你想讓顯微鏡識別更近的兩點，你要縮小它們Δx。

   

考慮照明光波長（λ）在人眼可辨范圍內(nèi)（400-760nm），所以要讓Δx更大，λ更小是400nm左右。

   

n它是光路介質(zhì)的折射率。一般來說，空氣n=1。另外，α是入射光角，理想是90°，這對任何顯微鏡都是一樣的，盡管它永遠不會達到理想的情況。帶入阿貝公式計算，Δx更大值約為200nm。

   

   

考慮到病毒的直徑100nm左右，200nm分辨率肯定看不清楚。

   

阿貝公式告訴我們，我們想減少它Δx(增加分辨率)有兩種方法，一種是將病毒轉(zhuǎn)移到透鏡之間的介質(zhì)折射率n減是減少光的波長。

   

更容易實現(xiàn)的就是把n有一種顯微技術(shù)叫做油浸物鏡。以折射率較高的油作為傳光介質(zhì)，可以使用n提高到1.4因此，普通光學顯微鏡和油浸物鏡的配合可以將分辨率提高到約150nm。

   

   

即使分辨率達到了，這個分辨率還遠遠不夠100nm，只能說勉強能判斷病毒兩端的點，具體想看看病毒長什么樣，分辨率不到5nm想都別想。

   

因此，我們應(yīng)該走另一條不同于降低折射率的道路：使用波長較短的光源。

   

   

考慮到普通光學顯微鏡使用光子，自然會考慮是否可以用短波長光子代替可見光，然后用傳感器收集光信號代替人眼觀察。

   

X例如，射線波長足夠小Cu-Kα射線可以達到0.15個nm，可見光直接使用400nm三個數(shù)量級下降，分辨率自然大大提高。然而，這太理想化了。

   

實際上，X光源強度往往不夠大，傳感器無法測量足夠的數(shù)據(jù)，X射線光子難以聚焦，精確分析是幻想。

   

有趣的是，從 ** 5年倫琴用X射線開始拍攝各種物體，科學家們絞盡腦汁思考X當光源顯示微鏡時，射線。

   

   

左:倫琴妻子的手，右:倫琴

   

但是，直到它的競爭對手(本文的主角，拍攝COVID-19病毒)獲得諾貝爾獎，X由于同步輻射光源、高性能檢測器和高性能檢測器，射線顯微鏡才真正制造出來。Fresnel使用波帶片。

   

大活人還能憋死尿嗎？X當時的科學家干脆放棄用光子作為光源！

   

   

電子顯微鏡

   

由于需要短波長的光源，因此更好使用電子。短波電子很容易獲得，只需給出足夠大的加速電壓。動能上升后，根據(jù)德布羅的意義，波長較短。

   

它們的波長甚至可以達到0.1nm電子顯微鏡的分辨率也可以達到幾個水平nm，有足夠的分辨率觀察病毒。

   

   

電子槍原理

   

與聚光子相比，聚電子更容易。與光學玻璃鏡頭相比，電子顯微鏡使用的鏡頭是電磁鏡頭，其原理也非常簡單。移動電子將由磁場控制，磁場由電線圈創(chuàng)建，大小和方向可控。

   

此外，考慮到電子粒子性強，需要在整個光路上保持真空環(huán)境，否則電子束流不集中。這也更容易實現(xiàn)。具體來說，人造真空的科學：從浴室拔罐到芯片光刻機

   

   

更后，這些電子產(chǎn)品與樣品相互作用后，會攜帶樣品信息，用傳感器收集放大信號，分析后就可以得到樣品的外觀。剛才的問號圖其實是電鏡。

   

   

短波長電子顯示出明顯的粒子性。電子槍發(fā)出的電子通過電磁透鏡聚集在一起，然后擊中樣品。這些電子和樣品有兩種方式：一種是原路返回，另一種是傲慢的穿越。這兩個原理對應(yīng)于兩個電鏡。

   

掃描電子顯微鏡（SEM）

   

主要有兩種電子：背散射線和二次電子。收集和放大這兩種電子信號，即SEM成像原理。

   

   

背散射電子是指固體樣品原子反射的部分入射電子，對樣品成分敏感，如元素類型。

   

二 二級電子是指被入射電子轟擊的核外電子，對病毒與環(huán)境的差異等樣品表面形狀敏感。

   

   

這張圖是關(guān)于更近發(fā)布的COVID-19的SEM照片主要依靠二次電子信號，可以清楚地看到病毒在背景上呼之欲出，具有立體感。

   

值得一提的是，這張SEM圖紙修復后。

   

據(jù)我所知，目前還沒有電子顯微鏡可以單獨拍攝彩色圖片，因為傳感器主要檢測 電子強度（數(shù)量）信號，這意味著只能在白色和黑色之間取灰色，不能在白色和黑色之間取紅色、黃色、藍色和綠色。下圖是真的SEM圖像。

   

   

還是黑白看著順眼？

   

透射電子顯微鏡（TEM）

   

除了原路返回子外，還有直接通過樣品的透射電子。

   

   

考慮到有病毒的地方和沒有病毒的地方的物質(zhì)組成不同，入射電子的散射能力也不同。

   

例如，重元素的原子具有較強的電子散射能力，透射電子無法通過，圖像較暗。同樣的元素，樣品越厚，透射電子就越難通過。這將形成 厚的襯里。

   

通過收集和分析透射電子強度信號，可以實現(xiàn)成像。使用此原理的電鏡是TEM。

   

   

這個也是PS后的

   

   

冠狀病毒看起來仍然很可愛

   

可以看出，相比采集二次電子的SEM，TEM圖像沒有立體感，主要是因為后者采集透射電子，樣品沿厚度方向平等。

   

無論10nm厚度處還是20nm，只要一個地方有足夠多、足夠重的原子覆蓋電子，這個區(qū)域更終呈現(xiàn)的圖像就是黑暗的，比如病毒的蛋白質(zhì)外殼。

   

當然，部分原因是為了讓透射電子獲得足夠的信號成像，如果樣品太厚，就會變黑，所以樣品要減少到100nm在這個厚度下，立體感很難維持。

   

說到制樣，不得不說SEM和TEM樣品是一個大學問題，提取病毒后不能立即拍攝。

   

   

例如，等離子體將被用來鍍金生物樣品

   

部分操作與分子烹飪非常相似，如液氮、真空環(huán)境等，下一篇文章簡要討論，感興趣歡迎關(guān)注。

   

結(jié)語

   

"It is very easy to answer ** ny fundamental biological questions; you just look at the thing!" Richard Feyn ** n

   

恐懼來自未知，沒有什么比看到敵人更放心了。從視覺識別、光學顯微鏡到直接看到COVID-19的SEM和TEM，人類的歷史是求索并創(chuàng)造的史詩。

   

對病毒，我們已經(jīng)有了比前人更強大的武器，應(yīng)該有足夠的信心，平和而堅定地面對它們。