【基本原理】

通常情況下，細(xì)胞骨架不穩(wěn)定，如低溫、高壓、饑餓酸處理等。當(dāng)濃度適當(dāng)時(shí)TritonX-100 在處理細(xì)胞時(shí)，可溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞中的許多蛋白質(zhì)，而細(xì)胞骨架系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)不被破壞顯得更清晰，M-用緩沖液清洗細(xì)胞可以提高細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。戊二醛固定可以更好地保存細(xì)胞骨架的成分R250 染色后，細(xì)胞骨架蛋白可以著色，而細(xì)胞背景著色較弱，有利于細(xì)胞骨架纖維的顯示。

微絲、微管和中間纖維直徑小，*大的單根微管25nm 只能在電鏡下觀察到。目前，研究細(xì)胞骨架的主要方法是應(yīng)用高壓電鏡或免疫熒光顯微鏡技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)用普通光鏡觀察細(xì)胞骨架，因?yàn)楣羌芾w維的成束分布和結(jié)構(gòu)被染色。因?yàn)榧?xì)胞通過TritonX-100 提取后剩余的主要是細(xì)胞骨架成分，使顯示更加清晰。細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)中縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，根據(jù)成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們在維持細(xì)胞形態(tài)、生長、運(yùn)動(dòng)、分裂、分化和物質(zhì)運(yùn)輸方面發(fā)揮著重要作用。Triton X-100 可以溶解細(xì)胞膜，保存細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，然后使用考馬斯亮蘭R250 染色使細(xì)胞骨架清晰顯現(xiàn)。

【實(shí)驗(yàn)用品】

1材料：新鮮洋蔥鱗莖

2試劑 1) M 緩沖液（pH 7.2）各成分的*終濃度為：

50mmol/L 咪唑(MW:68.08)； 50mmol/L KCl(MW:74.55)；

0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30)； 1mmol/L EGTA(MW:380.36)；

0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)； 1mmol/L DTT(MW:154.3)

2） 6mmol/L PBS 磷酸緩沖液 （pH 6.5）：KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:3

3） 0.7% NaCl 生理鹽水

4） 1% Triton X-100 溶于 M-緩沖液

5） 3% 戊二醛100mL: 取25% 戊二醛12mL，PBS 88mL

6） 0.2% 考馬斯亮藍(lán)R250 染液 200mL：考馬斯亮藍(lán)R250 0.2g；甲醇 46.5mL；冰乙酸 7mL；蒸餾水46.5mL

3儀器：光學(xué)顯微鏡、鑷子、剪刀、試管、表面容器、滴管、玻片蓋

方法步驟

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

與內(nèi)表皮細(xì)胞相比(放大倍數(shù))10×20）

附件：各種主要試劑的作用

1．Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用:非離子去垢劑；濃度適當(dāng)?shù)腡riton X-100，細(xì)胞膜可以溶解，細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架系統(tǒng)可以保存。

2．M－緩沖液和磷酸緩沖液作用：維持細(xì)胞的滲透壓。

3．EDTA(乙二胺四乙酸)和EGTA(乙二醇雙醚四乙酸)作用:前者可螯合大部分金屬離子；后者是專用螯合Ca2+，主要是高濃度Ca2+但是微管解聚，所以加入EGTA 來降低Ca2＋的濃度。

4。戊二醛功能：良好的固定劑，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持原狀；

5考馬斯亮蘭功能：非專一性與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)著色(藍(lán)色)。