在過去二十多年中，光學(xué)顯微成像技術(shù)發(fā)展迅速，不斷突破傳統(tǒng)極限。生命科學(xué)研究，要求成像系統(tǒng)在不影響生物活性的前提下，實(shí)現(xiàn)更大視野，更高分辨率，更高速度的三維成像。這也意味著對成像探測器 - 科研相機(jī)的要求也越來越高。

從本周開始，我們將為大家?guī)砬把仫@微成像技術(shù)專題系列，和大家一起探討前沿的顯微成像技術(shù)以及他們對科研相機(jī)的相關(guān)性能要求。

首期我們的主角是近年來廣受關(guān)注和發(fā)展的光片熒光顯微鏡（Light Sheet Fluorescence Microscopy） 。

光片熒光顯微鏡的誕生

大家知道，傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡通過物鏡將激發(fā)光聚焦，同時(shí)收集樣品的熒光信號成像。觀察其照明方式(圖1)不難發(fā)現(xiàn)，雖然焦平面上的光*強(qiáng)，但其上下的樣品也會被照亮，導(dǎo)致以下局限性：

• 引入額外的光毒性，影響樣品生物活性，甚至造成細(xì)胞死亡；

• 成像焦平面以外的干擾信號進(jìn)入圖像，導(dǎo)致圖像分辨率和反差降低。

激光掃描共聚焦使用點(diǎn)掃描方法，通過在探測端引入針孔，濾除了焦平面以外的雜散光，使分辨率，特別是Z軸方向的分辨率得到了提升，能夠?qū)崿F(xiàn)三維成像。但是，當(dāng)激發(fā)光聚焦時(shí)，仍然會照亮上下區(qū)域（圖2）。由于使用點(diǎn)掃描方式成像，為達(dá)到較快光的速度，光束照射每個(gè)點(diǎn)的時(shí)間很短，成像元件（PMT）的量子效率又很低，需要更強(qiáng)的激發(fā)功率。與傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡相比，光漂白和光毒性更加嚴(yán)重。

1990年發(fā)明的雙光子激光掃描顯微鏡是減少光毒性的一個(gè)好方法。由于使用近紅外激光照明，對活體樣品的光毒性大大降低，并且能夠穿透更深的樣品。但是，雙光子的信號很弱，采集速度非常慢，不適合對大樣品進(jìn)行動態(tài)成像。而且其昂貴的成本也限制了應(yīng)用范圍。

聽起來要同時(shí)滿足大視野，高分辨率，高速度和低的光損傷是一件令人頭禿的事，不過這是難不倒科學(xué)家們的。
事實(shí)上早在1903年，席格蒙迪（Richard Zsigmondy）和西登托夫（Henry Siedentopf）就發(fā)明了通過一個(gè)狹縫生成光片照明的超顯微鏡(Ultra microscope)，但是他們的方法并未進(jìn)一步發(fā)展到熒光成像。
直到1993年，華盛頓大學(xué)Voie和他的同事提出了正交平面熒光切片技術(shù) (Orthogonal Plane Fluorescence Optical Sectioning，OPFOS)。
2004年，Ernst Stelzer和同事進(jìn)一步發(fā)展了這個(gè)idea，搭建出一臺新的熒光顯微鏡，他們稱之為SPIM(單平面照明顯微鏡, Selective / Single Plane Illumination Microscopy)，也就是我們現(xiàn)在所知道的光片熒光顯微鏡。

什么是“光片”？

光片顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的不同在于激發(fā)光的照明方式。它的照明光是一張與成像面平行的薄薄的“光片”(圖3)，只有焦平面的樣品被照亮，而其上下的樣品不受影響。

和傳統(tǒng)熒光照明方式相比，光片照明有如下優(yōu)點(diǎn)：

1. 提高了圖像和背景的反差(Signal-to-Background Ratio) 和軸向分辨率：光片照明技術(shù)保證了焦平面上下的樣品不會被激發(fā)，具備和共聚焦顯微鏡類似的光學(xué)切片功能；

2. 減少了光漂白和光毒性：與傳統(tǒng)的熒光照明技術(shù)相比，光毒性可以被降低20-100倍，這樣，我們就能在更接近生理狀態(tài)的條件下，對活體生物樣品進(jìn)行長時(shí)間的三維成像；

3. 與激光共聚焦和雙光子顯微鏡使用低QE的PMT的點(diǎn)掃描成像相比，光片顯微鏡使用高QE的CCD或sCMOS相機(jī)進(jìn)行面成像，大大提高了成像速度和圖像的信噪比。共聚焦需要幾分鐘甚至幾小時(shí)才能拍完的樣品，用光片顯微鏡只需要幾秒到幾分鐘。因此，光片顯微鏡也特別適合用于大樣品成像。
   

在多數(shù)光片系統(tǒng)中，光學(xué)元件是固定的，需要移動樣品 (或使光片從xyz方向掃過樣品) 來獲得完整的3D圖像。通過移動或旋轉(zhuǎn)樣品，可以對大樣品進(jìn)行成像，并從多個(gè)角度拍攝，將這些多視角圖像通過特別算法融合在一起后，能夠進(jìn)一步提高圖像分辨率，并修正一些光片技術(shù)特有的缺陷。

總之，光片熒光顯微鏡從設(shè)計(jì)原理上，大大降低了激發(fā)光對活體樣品的光毒性和光漂白，天生具有光學(xué)切片能力，使用高量子效率的CCD或sCMOS探測器，是大視野，高速，高分辨率三維活體顯微成像的理想工具。

“光片”的實(shí)現(xiàn)

產(chǎn)生光片*簡單的方法是在光路中引入一個(gè)圓柱形透鏡。通過該透鏡的光，寬度維持不變，但在高度上被壓縮成平面 (圖4)，然后通過照明物鏡，在焦面上形成“光片”。成像物鏡垂直于照明物鏡放置，并聚焦在光片上獲取熒光信號。

使用這種方法生成的光片，其寬度和厚度由照明物鏡的NA值決定。如圖5所示，照明光束的實(shí)際形狀是一個(gè)兩頭寬，中間細(xì)的“沙漏”形。ω0為光束腰厚度，也就是光片厚度，b為均勻照明寬度，也就是有效視野。

有如下公式：

因此，使用NA較小的照明物鏡，能夠?qū)崿F(xiàn)較寬范圍的均勻照明，即視野更大；但是相應(yīng)的，光片的厚度也越大，導(dǎo)致軸向分辨率降低。而高NA物鏡產(chǎn)生的光片視野會比較小，但軸向分辨率較好。

要注意的是，如果成像物鏡的NA值很高，使得其景深小于光片的厚度，那么系統(tǒng)的軸向分辨率主要是由成像物鏡的景深決定。但這時(shí)會產(chǎn)生普通熒光照明時(shí)具有的問題，即焦面上下的部分樣品會被照亮，不必要的光毒性和雜散光會對成像效果產(chǎn)生負(fù)面影響。
如果成像物鏡的NA值較低，光片厚度比它的景深要小，那么系統(tǒng)的軸向分辨率就由光片的厚薄來決定。

好啦！說了這么多，大家對光片顯微鏡是否有了一個(gè)基本印象了呢？什么？有點(diǎn)抽象？別急，在后面幾期中，我們將為大家詳細(xì)介紹“光片”的各種實(shí)現(xiàn)方式和不同的光片顯微鏡應(yīng)用，敬請期待！

References

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VoieA. H., Burns , D. H., Spelman, F. A. (1993) Orthogonal-plane fluorescenceoptical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biologicalspecimens. J Microsc. Jun;170(Pt 3):229-36.

Weber M, Mickoleit M and Huisken J (2014) Light Sheet Microscopy. Methods in Cell Biology. Jan 01; 123:193-215.